Participação da GTPase Rho na dinâmica do complexo juncional apical e do citoesqueleto de actina na progressão do câncer colorretal

A desmontagem do complexo juncional apical (CJA), que compreende as junções aderentes (JAs) e junções tight (JTs), e a reorganização do citoesqueleto de actina são etapas iniciais da progressão do câncer colorretal (CCR). Subsequentemente, as células adquirem um fenótipo migratório e invasivo, no entanto, os mecanismos moleculares que modulam esses eventos iniciais permanecem desconhecidos. O objetivo do presente estudo foi identificar as vias de sinalização envolvidas na regulação da dinâmica do CJA e do citoesqueleto de actina durante a progressão do CCR. Células de adenocarcinoma de cólon humano Caco-2, utilizadas como modelo de CCR, foram submetidas ao ensaio de retirada do cálcio do meio extracelular e ao tratamento com ácido lisofosfatídico (LPA), um ativador da GTPase Rho. Pré-tratamentos com inibidores específicos de vias de sinalização foram também utilizados nos diferentes ensaios. Na primeira etapa do estudo, verificamos que a retirada do cálcio extracelular ocasionou redistribuição das proteínas do CJA, conforme mostrado por imunofluorescência e immunoblotting usando frações solúveis e insolúveis em Triton X-100; perda da funcionalidade das JTs, como visto pelo decréscimo na resistência elétrica transepitelial (RET) e microscopia eletrônica de transmissão utilizando o traçador vermelho de rutênio; alterações no citoesqueleto de actina na região perijuncional e na distribuição das fibras de estresse, observados por microscopia confocal; e ativação localizada das GTPases Rho e Rac. Todos esses efeitos foram mediados por uma via de sinalização envolvendo a ativação de PKA e Rho-ROCK. Na segunda parte do estudo, observamos que o tratamento com LPA ocasionou redistribuição das proteínas do CJA e redução da expressão de E-caderina bem como reorganização do citoesqueleto de actina perijuncional, e aumento na formação de fibras de estresse. Além disso, o LPA causou: aumento da migração, mas não da invasão celular, como mostrado pelas técnicas do wound healing e de invasão em matrigel, respectivamente; formação de adesões focais, analisada pelo aumento da fosforilação da quinase de adesão focal (FAK) e imunofluorescência; ativação da GTPase Rho, mas não de Rac, conforme o ensaio de pull-down; e aumento do crescimento independente de ancoragem. Esses resultados mostram que o LPA modula as JAs, o citoesqueleto de actina e a migração celular através de uma via de sinalização que integra Rho-ROCK e Src-FAK. Em conclusão, juntos esses resultados mostram um papel central da via de sinalização Rho-ROCK na modulação do CJA e do citoesqueleto de actina durante a progressão do CCR, via que pode constituir um novo e alternativo alvo terapêutico no tratamento deste tipo de câncer

A desmontagem do complexo juncional apical (CJA), que compreende as junções aderentes (JAs) e junções tight (JTs), e a reorganização do citoesqueleto de actina são etapas iniciais da progressão do câncer colorretal (CCR). Subsequentemente, as células adquirem um fenótipo migratório e invasivo, no entanto, os mecanismos moleculares que modulam esses eventos iniciais permanecem desconhecidos. O objetivo do presente estudo foi identificar as vias de sinalização envolvidas na regulação da dinâmica do CJA e do citoesqueleto de actina durante a progressão do CCR. Células de adenocarcinoma de cólon humano Caco-2, utilizadas como modelo de CCR, foram submetidas ao ensaio de retirada do cálcio do meio extracelular e ao tratamento com ácido lisofosfatídico (LPA), um ativador da GTPase Rho. Pré-tratamentos com inibidores específicos de vias de sinalização foram também utilizados nos diferentes ensaios. Na primeira etapa do estudo, verificamos que a retirada do cálcio extracelular ocasionou redistribuição das proteínas do CJA, conforme mostrado por imunofluorescência e immunoblotting usando frações solúveis e insolúveis em Triton X-100; perda da funcionalidade das JTs, como visto pelo decréscimo na resistência elétrica transepitelial (RET) e microscopia eletrônica de transmissão utilizando o traçador vermelho de rutênio; alterações no citoesqueleto de actina na região perijuncional e na distribuição das fibras de estresse, observados por microscopia confocal; e ativação localizada das GTPases Rho e Rac. Todos esses efeitos foram mediados por uma via de sinalização envolvendo a ativação de PKA e Rho-ROCK. Na segunda parte do estudo, observamos que o tratamento com LPA ocasionou redistribuição das proteínas do CJA e redução da expressão de E-caderina bem como reorganização do citoesqueleto de actina perijuncional, e aumento na formação de fibras de estresse. Além disso, o LPA causou: aumento da migração, mas não da invasão celular, como mostrado pelas técnicas do wound healing e de invasão em matrigel, respectivamente; formação de adesões focais, analisada pelo aumento da fosforilação da quinase de adesão focal (FAK) e imunofluorescência; ativação da GTPase Rho, mas não de Rac, conforme o ensaio de pull-down; e aumento do crescimento independente de ancoragem. Esses resultados mostram que o LPA modula as JAs, o citoesqueleto de actina e a migração celular através de uma via de sinalização que integra Rho-ROCK e Src-FAK. Em conclusão, juntos esses resultados mostram um papel central da via de sinalização Rho-ROCK na modulação do CJA e do citoesqueleto de actina durante a progressão do CCR, via que pode constituir um novo e alternativo alvo terapêutico no tratamento deste tipo de câncer

Heparan sulfate proteoglycans: structure, protein interactions and cell signaling

Heparan sulfate proteoglycans are ubiquitously found at the cell surface and extracellular matrix in all the animal species. This review will focus on the structural characteristics of the heparan sulfate proteoglycans related to protein interactions leading to cell signaling. The heparan sulfate chains due to their vast structural diversity are able to bind and interact with a wide variety of proteins, such as growth factors, chemokines, morphogens, extracellular matrix components, enzymes, among others. There is a specificity directing the interactions of heparan sulfates and target proteins, regarding both the fine structure of the polysaccharide chain as well precise protein motifs. Heparan sulfates play a role in cellular signaling either as receptor or co-receptor for different ligands, and the activation of downstream pathways is related to phosphorylation of different cytosolic proteins either directly or involving cytoskeleton interactions leading to gene regulation. The role of the heparan sulfate proteoglycans in cellular signaling and endocytic uptake pathways is also discussed.

Proteoglicanos de heparam sulfato são encontrados tanto superfície celular quanto na matriz extracelular em todas as espécies animais. Esta revisão tem enfoque nas características estruturais dos proteoglicanos de heparam sulfato e nas interações destes proteoglicanos com proteínas que levam à sinalização celular. As cadeias de heparam sulfato, devido a sua variedade estrutural, são capazes de se ligar e interagir com ampla gama de proteínas, como fatores de crescimento, quimiocinas, morfógenos, componentes da matriz extracelular, enzimas, entreoutros. Existe uma especificidade estrutural que direciona as interações dos heparam sulfatos e proteínas alvo. Esta especificidade está relacionada com a estrutura da cadeia do polissacarídeo e os motivos conservados da cadeia polipeptídica das proteínas envolvidas nesta interação. Os heparam sulfatos possuem papel na sinalização celular como receptores ou coreceptores para diferentes ligantes. Esta ligação dispara vias de sinalização celular levam à fosforilação de diversas proteínas citosólicas ou com ou sem interações diretas com o citoesqueleto, culminando na regulação gênica. O papel dos proteoglicanos de heparam sulfato na sinalização celular e vias de captação endocítica também são discutidas nesta revisão.